Problemas con la prueba RT-PCR para coronavirus

David Crowe
23 de abril de 2020
Versión 3

 

Este es un análisis de la llamada prueba de coronavirus, basada en la tecnología RT-PCR. Se basa significativamente en mi reciente lectura de un artículo de 2017 sobre los posibles problemas de la RT-PCR por el profesor Stephen Bustin, un experto mundial, un podcast que recientemente realicé con él y las directrices del MIQE para operar e informar sobre los datos de la RT-PCR. Este artículo no cuestiona si el ARN utilizado en la prueba es viral o endógeno. Si el ARN no es viral, entonces claramente la prueba del coronavirus RT-PCR no tiene valor. Esta página web no contiene referencias, para las que debe consultar la Crítica de Pánico del Coronavirus completamente referenciada.


El número del ciclo de PCR

El algoritmo de PCR es cíclico. En cada ciclo genera aproximadamente el doble de la cantidad de ADN (que, en la RT-PCR, corresponde al ARN con el que se inició el proceso). Cuando se utiliza como prueba no se conoce la cantidad de material de partida, pero la cantidad de ADN al final de cada ciclo se mostrará indirectamente por medio de moléculas fluorescentes que están adheridas a las sondas. La cantidad de luz producida después de cada paso se duplicará entonces aproximadamente, y cuando alcance una cierta intensidad el proceso se detendrá y la muestra se declarará positiva (lo que implica que está infectada). Si, después de un cierto número de ciclos, todavía no hay suficiente ADN, entonces la muestra se declara negativa (lo que implica que no está infectada). Este número de ciclo (Ct) utilizado para separar los positivos de los negativos es arbitrario, y no es el mismo para todas las organizaciones que realizan pruebas. Por ejemplo, hay un documento publicado que informó de que se utilizaban 36 como límite para los positivos, 37-39 como indeterminado, lo que requería más pruebas, y más de 39 como negativo. En otro trabajo se utilizó 37 como límite, sin zona intermedia. En una lista de kits de prueba aprobados por la FDA de EE.UU., un fabricante recomendó 30 ciclos, 31, 35, 36, 37, 38 y 39 cada uno. 40 ciclos fue el más popular, elegido por 12 fabricantes, y uno de cada uno recomendó 43 y 45.


Significado de la Ct

Está implícita en el uso de un número Ct la suposición de que aproximadamente la misma cantidad de ARN original (dentro de un múltiplo de dos) producirá el mismo número Ct. Sin embargo, hay muchas posibilidades de error en la RT-PCR. Hay ineficiencias en la extracción del ARN, ineficiencias aún mayores en la conversión del ARN en ADN complementario (Bustin señaló que la eficiencia rara vez supera el 50% y puede variar fácilmente en un factor de 10), e ineficiencias en el propio proceso de PCR. Bustin, en el podcast, describió la dependencia de un número arbitrario de Ct como "una absoluta tontería, no tiene ningún sentido". Ciertamente no se puede suponer que el mismo número de Ct en pruebas realizadas en diferentes laboratorios indique la misma cantidad original de ARN.


Límites de los ciclos

El profesor Bustin declaró que montar en bicicleta más de 35 veces no era prudente, pero parece que nadie está limitando los ciclos a 35 o menos (las directrices del MIQE recomiendan menos de 40). Ciclando demasiado podría resultar en falsos positivos, ya que la fluorescencia de fondo se acumula en la reacción de PCR.


Ct y número de pruebas positivas

El número de ciclos de Ct influirá significativamente en el número de pruebas positivas. Si se cambiara el Ct de 37 a 35 habría menos pruebas positivas, y si se cambiara a 39 habría más pruebas positivas. Incluso si el número de Ct se normalizara, seguiría teniendo un significado diferente en función de las máquinas, productos químicos y procedimientos específicos utilizados por los distintos laboratorios, e incluso dentro del mismo laboratorio se podrían encontrar cambios entre distintas series de muestras. Sin amplificar simultáneamente una cantidad conocida de ARN "punzante", no se puede suponer que con números Ct consistentes se pueda utilizar para proporcionar sistemáticamente un límite entre positivo y negativo.


¿Tiene significado la cantidad?

Si el proceso es eficiente, un gran número de ciclos podría detectar tan sólo tres moléculas de ARN. Si hay personas que tienen una cantidad tan pequeña de virus en su cuerpo, sin causar problemas de salud, aún así darían positivo.


¿Es el virus funcional?

Si sólo hay partes de virus presentes, o partículas de virus defectuosas, que no son infecciosas, aún así darían positivo en las pruebas. Las pruebas no prueban la presencia de un virus patógeno y replicable.


¿Puede la RT-PCR distinguir entre infectados y no infectados

No.


Cómo funciona la RT-PCR en más detalle


Los siguientes pasos se utilizan para comprobar la existencia de un ARN en particular:

  1. El ARN debe ser extraído de una muestra. Esto debe hacerse cuidadosamente para asegurar que el ADN sea eliminado, y que no se incluyan sustancias químicas que puedan inhibir los pasos siguientes. Es imposible asegurar la pureza absoluta del ARN.
  2. El ARN debe convertirse en ADN complementario (ADNc). Este utiliza la enzima Transcriptasa Reversa y nunca es terriblemente eficiente (50%). La cantidad de ADN producida puede variar significativamente, dependiendo de numerosos factores, tal vez en un factor de 10 (antes era un factor de 100).
  3. En la parte del proceso de la PCR, el ADNc está presente con cebadores y una sonda (y posiblemente algo de ADN extraviado de la muestra). Los cebadores delimitan el comienzo y el final del ADNc que se pretende duplicar. La sonda ayuda a asegurar que el ARN sólo se duplique si coincide con los cebadores (que son bastante cortos) y la sonda. En cada ciclo de este proceso (PCR propiamente dicho) la cantidad de ADN se duplica aproximadamente. Se fijan marcadores fluorescentes a la sonda para que, en cada paso, se pueda utilizar la cantidad de luz para estimar cuánto ADN se ha generado.
  4. Opcionalmente, el ADN resultante puede ser secuenciado para determinar exactamente cuáles son las bases ('cadena de cuatro cuentas de ADN diferentes').

Pueden producirse errores e ineficiencias en cada paso. No es posible estimar realmente las cantidades, a menos que la reacción se 'dispare' con una cantidad conocida de un ARN diferente, que también se duplique. Entonces el número del ciclo de PCR puede correlacionarse aproximadamente con la cantidad original de material.


¿Hay pruebas de que hay problemas, o es sólo una hipótesis?

Ahora hay varios trabajos que ilustran resultados de pruebas esencialmente imposibles. Un trabajo de China informó sobre resultados de pruebas consecutivas, definidos como Negativos (N), Positivos (P) o Dudosos (D, presumiblemente intermedios). Los resultados de 29 personas con resultados inexplicables de unos 600 pacientes fueron: 1 DDPD 2 NNPN 3 NNNPN 4 DNPN 5 NNDP 6 NDP 7 DNP 8 NDDPN 9 NNNDPN 10 NNPD 11 DNP 12 NNNP 13 PPNDPN 14 PNPPP 15 DPNPNN 16 PNP 17 NPNPN 18 PNP 19 NPNP 20 PNPN 21 PNP 22 PNP 23 PNP 24 PNDP 25 PNPNN 26 PNPP 27 PNP 28 PNPN 29 PNP. Un estudio de Singapur hizo pruebas casi a diario en 18 pacientes y la mayoría pasó de positivo a negativo de vuelta a positivo por lo menos una vez, y hasta cuatro veces en un paciente. En China han encontrado que entre el 5 y el 14% de los pacientes que han sido absueltos, con dos pruebas negativas consecutivas, han vuelto a dar positivo, generalmente sin nuevos síntomas. En Corea del Sur, recientemente se informó de 91 pacientes de este tipo. Un hombre chino de 68 años fue al hospital con síntomas, y dio positivo. Después de que sus síntomas se resolvieron y dio negativo dos veces, fue dado de alta. Pero volvió a dar positivo, y fue readmitido, fue dado de alta de nuevo, volvió a dar positivo, fue readmitido, y luego fue dado de alta por tercera vez.


Conclusiones

Las pruebas de RT-PCR para el Coronavirus parecen estar diseñadas para producir el mayor número posible de pruebas positivas. El miedo a perder un verdadero positivo es tan grande que aquellos que diseñan la metodología de pruebas específicas basadas en RT-PCR ignoran completamente el riesgo de falsos positivos. Los falsos positivos hacen que la epidemia parezca más grande, y justifican el cierre completo de la economía, encerrando a la gente en sus propias casas, y destruyendo casi todo en la vida de las personas que les da alegría, como jugar a la pelota en el parque, ir a tomar café con un amigo, ir al teatro o a un evento deportivo, ir a nadar, ir a la feria del condado.

© Copyright 26 de mayo de 2020. David Crowe



Fuente: The Infectious Myth